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常見問題
- 抗體如何保存？
- 抗體保存的質(zhì)量直接決定了抗體的活性和使用效果，請務(wù)必按照說明書推薦的保存條件正確保存抗體，并且避免抗體反復(fù)凍融。
- 實驗操作中如何避免組織脫片？
- 1、組織處理不當(dāng)：按照《臨床技術(shù)操作規(guī)范 病理學(xué)分冊》進行組織處理，脫水徹底，盡量不選擇脂肪多的組織。
2、組織切片太厚、不均勻等，一般建議組織切片厚度在3-5μm，切片時保持切片的完整和均勻，避免出現(xiàn)褶皺。
3、抗原修復(fù)過程操作不當(dāng)，如修復(fù)過度或修復(fù)結(jié)束后迅速冷卻，請按照抗體說明書中建議的抗原修復(fù)方式，進行正確的抗原修復(fù)操作。
4、烤片條件不當(dāng)，如烤片溫度過低、時間過短等，建議烤片溫度高于包埋的石蠟熔點3-5℃（或60-70℃）為適，烤片時間為1-2h。
5、沖洗方式不當(dāng)，如沖洗時對著組織沖洗，請采用正確的沖洗方式加以避免。
- 組織切片染色結(jié)果為陰性，如何解決？
- 1、真陰性。設(shè)立“陽性對照”，如果陽性對照染色正常，可排除試劑和操作的原因。此時，如受測組織或細胞出現(xiàn)陰性染色，說明受測組織或細胞沒有相應(yīng)的抗原表達。
2、假陰性。 陽性對照和受測組織均顯示陰性。
（1） 實驗操作不當(dāng)，如漏加某一試劑、試劑滴加順序有誤、抗原修復(fù)操作有誤等。建議按照規(guī)范的實驗方法進行實驗；
（2）一抗與二抗檢測系統(tǒng)不相符。建議根據(jù)一抗的種屬選擇相匹配的檢測系統(tǒng)；
（3）抗原含量過低，建議使用具有放大效應(yīng)的二抗檢測系統(tǒng)；
（4）抗體稀釋比例過高或使用了不合適的抗體稀釋液。建議按照指導(dǎo)意見對抗體進行稀釋；
（5）抗體過了有效期或者抗體保存條件不當(dāng)。建議在有效期內(nèi)正確使用抗體產(chǎn)品；
（6）水溶性色原顯色后使用了含醇的復(fù)染液或用乙醇脫水，二甲苯透明（如AP-Red、AEC、BCIP/NBT等顯色試劑）。建議使用正確的復(fù)染液封片劑重新染色。
- 導(dǎo)致組織切片染色弱的原因有哪些？如何避免？
- 1、 標(biāo)本的固定：不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。查看一抗說明書或相關(guān)文獻，使用推薦的固定液（如10%中性緩沖福爾馬林固定液等）。
2、抗原的修復(fù)方式：煮沸修復(fù)和高壓修復(fù)是國際公認的較好的修復(fù)方式，但具體使用那種修復(fù)方式應(yīng)根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果或廠家說明書進行選擇。
3、抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出最佳的使用濃度。通常，如果背景染色很少或沒有，可適當(dāng)延長孵育時間。
4、切片上遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
5、 孵育時切片是否放置水平，否則會導(dǎo)致抗體流失。
- 產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？
- 1) 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色，這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。
2) 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。
3) 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。
4) 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果。
5) DAB孵育時間過長或濃度過高，可通過降低DAB濃度或者縮短孵育時間來降低背景染色。
6) PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。
7) 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色，確保實驗過程中保證切片的濕潤。
8) 抗體稀釋液的pH值偏低和封閉血清的失效。
